FastKing RT Kit (Με gDNase)

Το Α-1 RNA είναι υποβαθμισμένο

—— Καθαρίστε υψηλής ποιότητας RNA χωρίς μόλυνση. Το υλικό από το οποίο εξάγεται το RNA πρέπει να είναι όσο το δυνατόν πιο φρέσκο ​​για να αποφευχθεί η υποβάθμιση του RNA. Αναλύστε την ακεραιότητα του RNA σε μετουσιωμένη γέλη πριν από την αντίδραση RT. Μετά την εξαγωγή RNA, θα πρέπει να αποθηκευτεί σε 100% φορμαμίδιο. Εάν χρησιμοποιείται αναστολέας RNase, η θερμοκρασία θέρμανσης πρέπει να είναι <45 ° C και το pH πρέπει να είναι μικρότερο από 8,0, διαφορετικά ο αναστολέας θα απελευθερώσει όλη τη δεσμευμένη RNase. Επιπλέον, αναστολέας RNase πρέπει να προστεθεί σε διαλύματα που περιέχουν ≥ 0,8 mM DTT.

Το RNA A-2 περιέχει αναστολείς αντιδράσεων αντίστροφης μεταγραφής

—— Οι αναστολείς αντίστροφης μεταγραφής περιλαμβάνουν SDS, EDTA, γλυκερόλη, πυροφωσφορικό νάτριο, σπερμιδίνη, φορμαμίδη, άλας γουανιδίνης κ.λπ. Πλύνετε την καταβύθιση RNA με αιθανόλη 70% (ο/ο) για απομάκρυνση των αναστολέων.

A-3 Ανεπαρκής ανόπτηση των εκκινητών που χρησιμοποιούνται για τη σύνθεση του πρώτου κλώνου του cDNA

—— Καθορίστε ότι η θερμοκρασία ανόπτησης είναι κατάλληλη για τα αστάρια που χρησιμοποιούνται στο πείραμα. Για τυχαία εξαμερή, συνιστάται η διατήρηση της θερμοκρασίας στους 25 ° C για 10 λεπτά πριν φτάσετε στη θερμοκρασία αντίδρασης. Για εκκινητές ειδικά για γονίδια (GSP), δοκιμάστε άλλα GSP ή μεταβείτε σε oligo (dT) ή τυχαίο εξαμερές.

A-4 Μικρή ποσότητα αρχικού RNA

—— Αυξήστε την ποσότητα του RNA. Για δείγματα RNA μικρότερα από 50 ng, μπορεί να χρησιμοποιηθεί 0,1 μg έως 0,5 μg ακετυλ BSA στην πρώτη σύνθεση cDNA κλώνου

A-5 Η αλληλουχία στόχος δεν εκφράζεται στους ιστούς που αναλύθηκαν.

——Δοκιμάστε άλλους ιστούς.

Η αντίδραση PCR Α-6 αποτυγχάνει

——Για RT-PCR δύο σταδίων, το πρότυπο cDNA στο βήμα PCR δεν μπορεί να υπερβαίνει το 1/5 του όγκου αντίδρασης.

A-1 Μη ειδική ανόπτηση αστάρι και προτύπων

——Το άκρο 3'των εκκινητών δεν πρέπει να περιέχει 2-3 dG ή dC. Χρησιμοποιήστε εκκινητές ειδικούς για το γονίδιο στην πρώτη σύνθεση κλώνου αντί τυχαίων εκκινητών ή ολίγου (dT). Χρησιμοποιήστε υψηλότερη θερμοκρασία ανόπτησης στους πρώτους κύκλους και στη συνέχεια χαμηλότερη θερμοκρασία ανόπτησης. Χρησιμοποιήστε πολυμεράση Taq DNA θερμής εκκίνησης για PCR για να βελτιώσετε την ειδικότητα της αντίδρασης.

A-2 Κακός σχεδιασμός εκκινητών ειδικών για γονίδια

—— Ακολουθήστε τις ίδιες αρχές για το σχεδιασμό του αστάρι ενίσχυσης.

A-3 RNA μολυσμένο με γονιδιωματικό DNA

—— Θεραπεία RNA με PCR βαθμού DNase I. Δημιουργήστε μια αντίδραση ελέγχου χωρίς αντίστροφη μεταγραφή για να ανιχνεύσετε μόλυνση DNA.

Α-4 Σχηματισμός διμερούς αστάρι

——Σχεδιάστε αστάρια χωρίς συμπληρωματικές ακολουθίες στο άκρο 3 ’.

A-5 Πολύ υψηλό Mg²⁺ συγκέντρωση

—— Βελτιστοποιήστε το Mg²⁺ συγκέντρωση για κάθε συνδυασμό προτύπου και αστάρι

A-6 Μολυσμένο με ξένο DNA

—— Χρησιμοποιήστε άκρες ανθεκτικές σε αερολύματα και ένζυμα UDG.

A-1 Το περιεχόμενο του πρώτου προϊόντος είναι πολύ υψηλό

—— Μειώστε την ποσότητα του προϊόντος της πρώτης αλυσίδας στο συμβατικό στάδιο αντίδρασης PCR.

A-2 Πολύ υψηλή ποσότητα εκκινητή σε αντίδραση PCR

—— Μειώστε την είσοδο αστάρι.

A-3 Πάρα πολλοί κύκλοι

—— Βελτιστοποιήστε τις συνθήκες αντίδρασης PCR και μειώστε τον αριθμό κύκλου PCR.

A-4 Πολύ χαμηλή θερμοκρασία ανόπτησης

—— Αυξήστε τη θερμοκρασία ανόπτησης για να αποτρέψετε τη μη ειδική έναρξη και επέκταση.

A-5 Μη ειδική ενίσχυση θραυσμάτων ολιγονουκλεοτιδίων που δημιουργείται από την αποικοδόμηση του DNA του DNase —— Εξαγάγετε υψηλής ποιότητας RNA για να αποτρέψετε τη μόλυνση του DNA.

Το RT-PCR πρόκειται να αντιγράψει αντίστροφα το RNA σε cDNA και στη συνέχεια να χρησιμοποιήσει το αντίστροφα μεταγραμμένο cDNA ως πρότυπο για την αντίδραση PCR για να ενισχύσει το θραύσμα-στόχο. Επιλέξτε είτε τυχαίους εκκινητές, Oligo dT και εκκινητές ειδικά για γονίδια σύμφωνα με τις ειδικές συνθήκες του πειράματος. Όλοι οι παραπάνω εκκινητές μπορούν να χρησιμοποιηθούν για mRNA βραχείων ευκαρυωτικών κυττάρων χωρίς δομή φουρκέτας.

Τυχαίος εκκινητής: Κατάλληλο για μακρύ RNA με δομή φουρκέτας, καθώς και για όλα τα είδη RNA όπως rRNA, mRNA, tRNA, κλπ. Χρησιμοποιούνται κυρίως για αντίδραση RT-PCR μεμονωμένου προτύπου.

Oligo dT: Κατάλληλο για RNA με ουρά PolyA (προκαρυωτικό RNA, ευκαρυωτικό Oligo dT rRNA και tRNA δεν έχουν ουρές PolyA). Επειδή το Oligo dT συνδέεται με την ουρά PolyA, η ποιότητα των δειγμάτων RNA απαιτείται να είναι υψηλή και ακόμη και μια μικρή ποσότητα αποικοδόμησης θα μειώσει σημαντικά την ποσότητα πλήρους σύνθεσης cDNA.

Γονιδιοειδές αστάρι: Συμπληρωματικό της ακολουθίας προτύπου, κατάλληλο για καταστάσεις όπου είναι γνωστή η αλληλουχία στόχος.

Υπάρχουν δύο τρόποι:

1. Μέθοδος εσωτερικής αναφοράς: Θεωρητικά, το cDNA είναι θραύσματα DNA διαφορετικού μήκους, οπότε το αποτέλεσμα της ηλεκτροφόρησης είναι επίχρισμα. Εάν η αφθονία του RNA είναι χαμηλή, κανένα προϊόν δεν θα εμφανιστεί σε ηλεκτροφόρηση, αλλά αυτό δεν σημαίνει ότι κανένα προϊόν δεν θα ενισχυθεί με PCR. Γενικά, εσωτερική αναφορά μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση cDNA. Εάν η εσωτερική αναφορά έχει αποτελέσματα, η ποιότητα του cDNA μπορεί να διασφαλιστεί βασικά (σε μερικές περιπτώσεις, εάν το θραύσμα του γονιδίου στόχου είναι πολύ μεγάλο, μπορεί να υπάρχουν εξαιρέσεις).

2. Εάν υπάρχει γνωστό γονίδιο που ενισχύεται από αυτό το πρότυπο, μπορεί να επαληθευτεί από τους εκκινητές αυτού του γονιδίου. Η ενίσχυση της εσωτερικής αναφοράς δεν σημαίνει απαραίτητα ότι δεν υπάρχει πρόβλημα με το cDNA. Επειδή η εσωτερική αναφορά έχει μεγάλη αφθονία στο cDNA, είναι εύκολο να ενισχυθεί. Εάν το cDNA υποβαθμιστεί εν μέρει για διάφορους λόγους, από την άποψη της πιθανότητας, τα αποτελέσματα της PCR γονιδίων στόχου χαμηλής αφθονίας θα επηρεαστούν πολύ. Ενώ η εσωτερική αναφορά εξακολουθεί να είναι μεγάλη σε αφθονία, η ενίσχυση πιθανότατα δεν θα επηρεαστεί.

Μερική υποβάθμιση του RNA. Ανιχνεύστε την ακεραιότητα και καθαρίστε το RNA

Το περιεχόμενο RNA διαφορετικών ειδών μπορεί να είναι διαφορετικό, αλλά γενικά, το εξαγόμενο ολικό RNA πρέπει να περιέχει δύο διαυγείς ζώνες 28S και 18S σε ηλεκτροφόρηση πηκτής και η φωτεινότητα της πρώτης ζώνης θα πρέπει να είναι διπλάσια από αυτή του δεύτερου. Η ζώνη 5S υποδεικνύει ότι το RNA έχει υποβαθμιστεί και η φωτεινότητά του είναι ανάλογη με τον βαθμό υποβάθμισης. Η επιτυχής ενίσχυση της εσωτερικής αναφοράς δεν σημαίνει ότι δεν υπάρχει πρόβλημα με το RNA, επειδή η εσωτερική αναφορά είναι σε μεγάλη αφθονία, το RNA μπορεί να ενισχυθεί εφόσον η αποδόμηση δεν είναι σοβαρή. Το OD₂₆₀/OD₂₈₀ο λόγος καθαρού RNA που μετράται με φασματοφωτόμετρο πρέπει να είναι μεταξύ 1,9 και 2,1. Μια μικρή ποσότητα ακαθαρσίας πρωτεΐνης στο RNA θα μειώσει την αναλογία. Εφόσον η τιμή δεν είναι πολύ χαμηλή, το RT δεν θα επηρεαστεί. Αυτό που έχει μεγαλύτερη σημασία για την RT είναι η ακεραιότητα του RNA.

Η επέκταση του εσωτερικού γονιδίου αναφοράς μπορεί να υποδηλώνει μόνο ότι η RT πέτυχε, αλλά δεν σχετίζεται απαραίτητα με την ποιότητα του κλώνου του cDNA. Επειδή τα εσωτερικά θραύσματα αναφοράς είναι γενικά μικρά σε μέγεθος και υψηλά σε έκφραση, είναι ευκολότερο να έχουν επιτυχία στην αντίστροφη μεταγραφή. Ωστόσο, το μέγεθος και η έκφραση του γονιδίου στόχου ποικίλλει από γονίδιο σε γονίδιο. Η ποιότητα του cDNA δεν μπορεί να κριθεί μόνο με εσωτερική αναφορά ειδικά για τα θραύσματα -στόχους μεγαλύτερα από 2 kb.

Ορισμένα δείγματα έχουν πολύπλοκες δευτερεύουσες δομές ή έχουν πλούσιο περιεχόμενο GC ή είναι πολύτιμα με μικρή αφθονία. Σε αυτές τις περιπτώσεις, θα πρέπει να επιλεγεί η κατάλληλη αντίστροφη μεταγραφάση ανάλογα με το μέγεθος του θραύσματος στόχου και του δείγματος. Για πρότυπα RNA με υψηλό περιεχόμενο GC και πολύπλοκη δευτερεύουσα δομή, είναι δύσκολο να ανοίξει η δευτερεύουσα δομή σε χαμηλή θερμοκρασία ή με κοινή αντίστροφη μεταγραφάση. Για αυτά τα πρότυπα, μπορεί να επιλεγεί Quant Reverse Transcriptase, δεδομένου ότι η απόδοση της αντίστροφης μεταγραφής είναι προφανώς καλύτερη από αυτήν της ανάστροφης μεταγραφάσης της σειράς M-MLV, η οποία μπορεί να αντιγράψει αποτελεσματικά διάφορα πρότυπα RNA και να μεταγράψει RNA σε πρώτο κλώνο cDNA στο μέγιστο βαθμό. Όταν χρησιμοποιείται γενικό κιτ αντίστροφης μεταγραφάσης, το σύστημα 20 μl μπορεί να αντιγράψει αποτελεσματικά μόνο 1 μg του συνολικού RNA. Δώστε προσοχή στη μέγιστη χωρητικότητα RT του κιτ. Εάν το πρότυπο προστίθεται υπερβολικά, η αντίστροφη μεταγραφή θα ευνοήσει το RNA με μεγάλη αφθονία. Επομένως, είναι καλύτερο να μην υπερβείτε τη μέγιστη χωρητικότητα του συστήματος.

A-1 Προσδιορίστε εάν το RNA υποβαθμίζεται σοβαρά και εάν το RT είναι επιτυχές

Γενικά, ο λόγος της αποτυχίας της εσωτερικής ενίσχυσης αναφοράς προκαλείται συχνά από σοβαρή υποβάθμιση του RNA. Ένας άλλος πιθανός λόγος είναι η αντίστροφη αποτυχία μεταγραφής. Η εσωτερική αναφορά δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως πρότυπο για την αξιολόγηση της ποιότητας του μονόκλωνου cDNA, αλλά μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως πρότυπο για να κριθεί εάν η αντίστροφη μεταγραφή είναι επιτυχής εάν δεν υπάρχει πρόβλημα ποιότητας RNA. Το πιο σημαντικό πράγμα στην αντίστροφη διαδικασία μεταγραφής είναι η διατήρηση σταθερής θερμοκρασίας και σταθερού συστήματος αντίδρασης προκειμένου να βελτιωθεί η απόδοση της αντίδρασης.

A-2 Καθορίστε εάν οι εκκινητές για την ενίσχυση των εσωτερικών γονιδίων αναφοράς είναι αξιόπιστοι και εάν υπάρχουν προβλήματα με τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται στην PCR.

Για σχετική ποσοτικοποίηση, το RNA πρέπει να ποσοτικοποιηθεί πριν από την αντίστροφη μεταγραφή, το οποίο απαιτείται επίσης σε πολλά κιτ αντίστροφης μεταγραφής, για παράδειγμα, ποσοτικοποιήστε την είσοδο RNA ως 1 μg. Δεδομένου ότι το αντίστροφα μεταγραμμένο cDNA είναι ένα μικτό διάλυμα, που περιλαμβάνει RNA, oligo dT, ένζυμο, dNTP και ακόμη και λίγο κατάλοιπο DNA, θα προκληθεί απόκλιση, οπότε είναι αδύνατο να ποσοτικοποιηθεί με ακρίβεια το cDNA. Επομένως, η ποσοτικοποίηση του RNA είναι απαραίτητη. Λαμβάνοντας υπόψη ότι η απόδοση αντίστροφης μεταγραφής είναι η ίδια μεταξύ διαφορετικών δειγμάτων, η ποσότητα του cDNA που λαμβάνεται πρέπει να είναι η ίδια και η ποσοτική ανάλυση μπορεί να δείξει τη σύγκριση των επιπέδων έκφρασης διαφορετικών γονιδίων στην ίδια ποσότητα συνολικού RNA. Κατά την εκτέλεση σχετικής ποσοτικής PCR φθορισμού, μπορεί να μην απαιτείται ποσοτικό cDNA μετά την αντίστροφη μεταγραφή επειδή το εσωτερικό γονίδιο αναφοράς μπορεί να λειτουργήσει ως αναφορά.

Σχετίζεται κυρίως με τα γονίδια και η αντίστροφη μεταγραφή μακρού θραύσματος δεν είναι εφικτή για τα περισσότερα γονίδια. Πρώτον, η αποτελεσματικότητα της αντίστροφης μεταγραφής είναι πολύ χαμηλότερη από εκείνη της PCR. Δεύτερον, η πλούσια σε GC περιοχή και η δευτερογενής δομή πολλών γονιδίων περιορίζουν τόσο την αντίστροφη μεταγραφή όσο και την PCR. Τέλος, η πιστότητα και η αποτελεσματικότητα ενίσχυσης της PCR είναι δύσκολο να εγγυηθούν ταυτόχρονα. Στη διαδικασία της αντίστροφης μεταγραφής, κανείς δεν μπορεί να εγγυηθεί ότι θα λάβει μακρύ θραύσμα για γονίδια χαμηλής αντιγραφής, ειδικά χρησιμοποιώντας oligo dT. Όσο για το 5 'UTR με περισσότερο GC, είναι ακόμα πιο δύσκολο. Ως εκ τούτου, εξακολουθεί να είναι μια λογική μέθοδος αναστροφής της μεταγραφής με τυχαίους εκκινητές, εύρεση των φυσικών θέσεων διάσπασης στο θραύσμα -στόχο, ενίσχυση κατά τμήματα και στη συνέχεια εκτέλεση της περιοριστικής πέψης και σύνδεσης. Σε γενικές γραμμές, είναι δύσκολο να ενισχυθούν άμεσα θραύσματα μεγαλύτερα από 2 kb, αλλά δεν είναι πάντα αδύνατο να ληφθούν: 1. Πρώτα απ 'όλα, εγγυηθείτε την ακεραιότητα του RNA/mRNA και προτιμάται η εξαγωγή TRIZOL. 2. Το κιτ M-MLV RT-PCR μπορεί να χρησιμοποιηθεί άμεσα. Επεκτείνετε τον χρόνο ανόπτησης και αυξήστε σωστά τον αριθμό κύκλου στη διαδικασία ενίσχυσης. Εναλλακτικά, μπορεί να εφαρμοστεί ένθετη PCR ή να πραγματοποιήσει μία ή δύο αντιδράσεις πρώτα με κατάλληλα παρατεταμένο χρόνο μετουσίωσης και επέκτασης πριν από την κανονική ενίσχυση PCR, η οποία μπορεί να βοηθήσει στην επέκταση των θραυσμάτων. Δώστε προσοχή στην πιστότητα της πολυμεράσης. 3. Το Long Taq μπορεί να χρησιμοποιηθεί στην PCR για να επιτευχθούν ιδανικά αποτελέσματα. 4. Για εφαρμογή έκφρασης πρωτεΐνης, θα πρέπει να εφαρμοστεί πολυμεράση υψηλής πιστότητας.

Υπάρχουν δύο είδη αντίστροφης μεταγραφάσης που προσφέρει η TIANGEN: Quant/King RTase και TIANScript M-MLV. Η κύρια διαφορά μεταξύ τους είναι η ποσότητα εισόδου των προτύπων. Το Quant είναι μια μοναδική αντίστροφη μεταγραφάση, η οποία είναι διαφορετική από την κοινώς χρησιμοποιούμενη M-MLV που προέρχεται από τον ιό λευχαιμίας ποντικών Moloney. Το Quant είναι μια νέα αντίστροφη μεταγραφάση υψηλής απόδοσης ανασυνδυαστικά εκφρασμένη από τη μηχανική Escherichia coli. Το Quant είναι κατάλληλο για ενίσχυση 50 ng-2 μg RNA με υψηλή αντίστροφη μεταγραφική δραστηριότητα και υψηλή απόδοση. Σε σύγκριση με τα συνηθισμένα MMLV ή AMV, το μεγαλύτερο χαρακτηριστικό του Quant είναι ότι έχει πολύ ισχυρή συγγένεια με πρότυπα RNA και μπορεί να αντιστρέψει σύνθετα πρότυπα μεταγραφής χωρίς μετουσίωση υψηλής θερμοκρασίας. Για πρότυπα με υψηλότερο περιεχόμενο GC, η αντίστροφη απόδοση είναι υψηλότερη. Ωστόσο, αυτή η αντίστροφη μεταγραφάση έχει δραστηριότητα RNase H, η οποία μπορεί να επηρεάσει το μήκος του προϊόντος cDNA (κατάλληλο για πρότυπα <4,5 kb). Για συμβατική αντίστροφη μεταγραφή, συνιστάται η αντίστροφη μεταγραφάση TIANScript MMLV. Αυτή η RTase είναι ένα τροποποιημένο ένζυμο με πολύ ασθενή δραστηριότητα RNase H, το οποίο είναι κατάλληλο για μακρά (> 5 kb) σύνθεση cDNA.

Η ανάστροφη μεταγραφή ενός σταδίου και η ενίσχυση PCR ολοκληρώνονται στον ίδιο σωλήνα χωρίς να ανοίγεται το κάλυμμα του σωλήνα μεταξύ σύνθεσης και ενίσχυσης cDNA, κάτι που βοηθά στη μείωση της μόλυνσης. Δεδομένου ότι όλα τα δείγματα cDNA που λαμβάνονται χρησιμοποιούνται για ενίσχυση, η ευαισθησία είναι υψηλότερη, με ελάχιστο 0,01 pg του ολικού RNA. Για την επιτυχή RTPCR ενός σταδίου, γενικοί ειδικοί εκκινητές χρησιμοποιούνται γενικά για την έναρξη της σύνθεσης cDNA. Η μέθοδος δύο βημάτων, δηλαδή η αντίστροφη μεταγραφή και η ενίσχυση PCR πραγματοποιείται σε δύο βήματα. Πρώτον, η αντίστροφη μεταγραφή πραγματοποιείται από ένα πρότυπο RNA για να ληφθεί cDNA και το ληφθέν cDNA υποβάλλεται σε μία ή περισσότερες διαφορετικές αντιδράσεις PCR. Η μέθοδος δύο σταδίων μπορεί να χρησιμοποιήσει oligo (dT) ή τυχαίους εκκινητές για να καθοδηγήσει τη σύνθεση του πρώτου κλώνου του cDNA και μπορεί να αντιγράψει αντίστροφα όλες τις πληροφορίες mRNA από ένα συγκεκριμένο δείγμα.