TIANSeq DirectFast Library Kit (illumina)

Προς το παρόν, η τεχνολογία προσδιορισμού αλληλουχίας υψηλής απόδοσης βασίζεται κυρίως στην τεχνολογία αλληλουχίας επόμενης γενιάς. Καθώς το μήκος ανάγνωσης της τεχνολογίας αλληλουχίας επόμενης γενιάς είναι περιορισμένο, πρέπει να σπάσουμε την ακολουθία πλήρους μήκους σε μικρές βιβλιοθήκες τεμαχίων για αλληλουχία. Σύμφωνα με τις ανάγκες των διαφορετικών πειραμάτων αλληλουχίας, συνήθως επιλέγουμε αλληλουχία με ένα άκρο ή αλληλουχία διπλού άκρου. Επί του παρόντος, τα θραύσματα DNA της βιβλιοθήκης αλληλουχίας επόμενης γενιάς κατανέμονται γενικά στην περιοχή 200-800 bp.

α) Το DNA είναι κακής ποιότητας και περιέχει αναστολείς. Χρησιμοποιήστε δείγματα DNA υψηλής ποιότητας για να αποφύγετε την αναστολή της ενζυμικής δραστηριότητας.

β) Η ποσότητα του δείγματος DNA είναι ανεπαρκής όταν χρησιμοποιείται μέθοδος χωρίς PCR για την κατασκευή βιβλιοθήκης DNA. Όταν η είσοδος του κατακερματισμένου DNA υπερβαίνει τα 50 ng, η ροή εργασίας χωρίς PCR μπορεί να πραγματοποιηθεί επιλεκτικά κατά τη διαδικασία κατασκευής της βιβλιοθήκης. Εάν ο αριθμός αντιγραφής της βιβλιοθήκης είναι πολύ χαμηλός για να αλληλουχηθεί άμεσα, η βιβλιοθήκη DNA μπορεί να ενισχυθεί με PCR μετά τη σύνδεση του προσαρμογέα.

γ) Η μόλυνση από RNA οδηγεί σε ανακριβή αρχική ποσοτικοποίηση DNA Μόλυνση από RNA μπορεί να υπάρχει στη διαδικασία καθαρισμού του γονιδιωματικού DNA, γεγονός που μπορεί να οδηγήσει σε ανακριβή ποσοτικοποίηση του DNA και ανεπαρκή φόρτωση του DNA κατά τη διάρκεια της κατασκευής της βιβλιοθήκης. Το RNA μπορεί να αφαιρεθεί με θεραπεία με RNase.

Α'1

α) Εμφανίζονται μικρά θραύσματα (60 bp-120 bp) Τα μικρά θραύσματα είναι συνήθως θραύσματα προσαρμογέα ή διμερή που σχηματίζονται από προσαρμογείς. Ο καθαρισμός με μαγνητικά σφαιρίδια Agencourt AMPure XP μπορεί να αφαιρέσει αποτελεσματικά αυτά τα θραύσματα προσαρμογέα και να εξασφαλίσει ποιότητα αλληλουχίας.

β) Μεγάλα θραύσματα εμφανίζονται στη βιβλιοθήκη μετά από ενίσχυση PCR Το μέγεθος του θραύσματος DNA της βιβλιοθήκης θα αυξηθεί κατά 120 bp μετά τη σύνδεση του προσαρμογέα. Εάν το θραύσμα DNA αυξηθεί κατά περισσότερο από 120 bp μετά τη σύνδεση του προσαρμογέα, μπορεί να προκληθεί από ανώμαλη ενίσχυση θραύσματος υπερβολικής ενίσχυσης PCR. Η μείωση του αριθμού των κύκλων PCR μπορεί να αποτρέψει την κατάσταση.

γ) Μη φυσιολογικό μέγεθος θραυσμάτων DNA βιβλιοθήκης μετά από απολίνωση προσαρμογέα Το μήκος του προσαρμογέα σε αυτό το κιτ είναι 60 bp. Όταν τα δύο άκρα του θραύσματος συνδέονται με τους προσαρμογείς, το μήκος θα αυξηθεί μόνο κατά 120 bp. Όταν χρησιμοποιείτε προσαρμογέα διαφορετικό από αυτόν που παρέχεται από αυτό το κιτ, επικοινωνήστε με τον προμηθευτή για να παράσχετε σχετικές πληροφορίες, όπως το μήκος του προσαρμογέα. Βεβαιωθείτε ότι η ροή εργασίας και η λειτουργία του πειράματος ακολουθούν τα βήματα που περιγράφονται στο εγχειρίδιο.

δ) Μη φυσιολογικό μέγεθος θραύσματος DNA πριν από τη σύνδεση του προσαρμογέα Ο λόγος για αυτό το πρόβλημα μπορεί να προκληθεί από λάθος συνθήκες αντίδρασης κατά τον κατακερματισμό του DNA. Πρέπει να χρησιμοποιούνται διαφορετικοί χρόνοι αντίδρασης για διαφορετική είσοδο DNA. Εάν η είσοδος DNA είναι μεγαλύτερη από 10 ng, συνιστούμε να επιλέξετε τον χρόνο αντίδρασης των 12 λεπτών ως χρόνο έναρξης για βελτιστοποίηση και το μέγεθος του τεμαχίου που παράγεται εκείνη τη στιγμή κυμαίνεται κυρίως από 300-500 bp. Οι χρήστες μπορούν να αυξήσουν ή να μειώσουν το μήκος των θραυσμάτων DNA για 2-4 λεπτά σύμφωνα με τις δικές τους απαιτήσεις για να βελτιστοποιήσουν τα θραύσματα DNA με το απαιτούμενο μέγεθος.

Α2

α) Ο χρόνος κατακερματισμού δεν βελτιστοποιείται Εάν το κατακερματισμένο DNA είναι πολύ μικρό ή πολύ μεγάλο, ανατρέξτε στις Οδηγίες για την επιλογή του χρόνου κατακερματισμού που παρέχονται στην οδηγία για τον προσδιορισμό του χρόνου αντίδρασης και χρησιμοποιήστε αυτό το χρονικό σημείο ως στοιχείο ελέγχου, σύστημα αντίδρασης για παράταση ή συντόμευση 3 λεπτών για ακριβέστερη προσαρμογή στο χρόνο κατακερματισμού.

Α-3

Μη φυσιολογική κατανομή μεγέθους του DNA μετά από θεραπεία κατακερματισμού

α) Λανθασμένη μέθοδος απόψυξης του αντιδραστηρίου κατακερματισμού, ή το αντιδραστήριο δεν αναμειγνύεται πλήρως μετά την απόψυξη. Αποψύξτε το αντιδραστήριο 5 × Fragmentation Enzyme Mix στον πάγο. Μόλις αποψυχθεί, αναμείξτε το αντιδραστήριο ομοιόμορφα, ανακινώντας απαλά το κάτω μέρος του σωλήνα. Μην στροβιλίζετε το αντιδραστήριο!

β) Το δείγμα εισόδου DNA περιέχει EDTA ή άλλους ρύπους Η εξάντληση ιόντων άλατος και χηλικών παραγόντων στο στάδιο καθαρισμού του DNA είναι ιδιαίτερα σημαντική για την επιτυχία του πειράματος. Εάν το DNA διαλυθεί σε 1 × TE, χρησιμοποιήστε τη μέθοδο που παρέχεται στην οδηγία για να εκτελέσετε κατακερματισμό. Εάν η συγκέντρωση EDTA στο διάλυμα είναι αβέβαιη, συνιστάται ο καθαρισμός του DNA και η διάλυση του σε απιονισμένο νερό για μετέπειτα αντίδραση.

γ) Ανακριβής αρχικός ποσοτικός προσδιορισμός DNA Το μέγεθος του κατακερματισμένου DNA σχετίζεται στενά με την ποσότητα του DNA που εισάγεται. Πριν από τη θεραπεία κατακερματισμού, η ακριβής ποσοτικοποίηση του DNA χρησιμοποιώντας Qubit, Picogreen και άλλες μεθόδους είναι απαραίτητη για τον προσδιορισμό της ακριβούς ποσότητας DNA στο σύστημα αντίδρασης.

 δ) Η προετοιμασία του συστήματος αντίδρασης δεν ακολουθεί τις οδηγίες Η προετοιμασία του κατακερματισμένου συστήματος αντίδρασης πρέπει να πραγματοποιείται σε πάγο αυστηρά σύμφωνα με τις οδηγίες. Για να εξασφαλιστεί το καλύτερο αποτέλεσμα, όλα τα συστατικά της αντίδρασης πρέπει να τοποθετηθούν σε πάγο και η προετοιμασία του συστήματος αντίδρασης πρέπει να πραγματοποιηθεί μετά από πλήρη ψύξη. Αφού ολοκληρωθεί η προετοιμασία, παρακαλούμε κτυπήστε ή πιπέτα για να αναμειχθεί καλά. Μην στροβιλίζεστε!

1. Η ακατάλληλη μέθοδος ανάμιξης (δίνη, βίαιη ταλάντωση κ.λπ.) θα προκαλέσει ανώμαλη κατανομή των θραυσμάτων βιβλιοθήκης (όπως φαίνεται στο παρακάτω σχήμα), επηρεάζοντας έτσι την ποιότητα της βιβλιοθήκης. Επομένως, κατά την προετοιμασία του διαλύματος αντίδρασης Fragmentation Mix, παρακαλούμε πιπερώστε απαλά προς τα πάνω και προς τα κάτω για ανάμειξη ή χρησιμοποιήστε την άκρη του δακτύλου για να ανακινείτε και να ανακατεύετε ομοιόμορφα. Προσέξτε να μην αναμειχθεί με δίνη.

2. Για την κατασκευή βιβλιοθηκών πρέπει να χρησιμοποιείται DNA υψηλής καθαρότητας

■ Καλή ακεραιότητα DNA: Η ζώνη ηλεκτροφόρησης είναι μεγαλύτερη από 30 kb, χωρίς ουρά

■ OD260/230:> 1,5

■ OD260/280: 1,7-1,9

3. Η ποσότητα εισαγωγής DNA πρέπει να είναι ακριβής Προτείνεται η χρήση μεθόδων Qubit και PicoGreen για τον ποσοτικό προσδιορισμό του DNA, αντί για Nanodrop.

4. Το περιεχόμενο του EDTA στο διάλυμα DNA πρέπει να προσδιοριστεί Το EDTA έχει μεγάλη επίδραση στην αντίδραση κατακερματισμού. Εάν το περιεχόμενο του EDTA είναι υψηλό, πρέπει να γίνει καθαρισμός του DNA πριν από την επόμενη δοκιμή.

5. Το διάλυμα της αντίδρασης κατακερματισμού πρέπει να παρασκευαστεί σε πάγο. Προκειμένου να διασφαλιστεί η ακρίβεια του χρόνου αντίδρασης, παρακαλώ προετοιμάστε το σύστημα αντίδρασης στον πάγο.

6. Ο χρόνος αντίδρασης κατακερματισμού πρέπει να είναι ακριβής Ο χρόνος αντίδρασης του σταδίου κατακερματισμού θα επηρεάσει άμεσα το μέγεθος των προϊόντων θραύσματος, επηρεάζοντας έτσι την κατανομή μεγέθους των θραυσμάτων DNA στη βιβλιοθήκη.

1. Τι είδους δείγμα ισχύει για αυτό το κιτ;

Ο εφαρμοστέος τύπος δείγματος αυτού του κιτ μπορεί να είναι ολικό RNA ή καθαρισμένο mRNA με καλή ακεραιότητα RNA. Εάν χρησιμοποιείται συνολικό RNA για την κατασκευή της βιβλιοθήκης, συνιστάται η χρήση του κιτ εξάντλησης του rRNA (Cat#4992363/4992364/4992391) για την αφαίρεση του rRNA πρώτα.

2. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν δείγματα FFPE για την κατασκευή βιβλιοθήκης με αυτό το κιτ;

Το mRNA στα δείγματα FFPE θα υποβαθμιστεί σε κάποιο βαθμό, με σχετική κακή ακεραιότητα. Όταν χρησιμοποιείτε αυτό το κιτ για την κατασκευή της βιβλιοθήκης, συνιστάται η βελτιστοποίηση του χρόνου κατακερματισμού (συντομεύστε το χρόνο κατακερματισμού ή μη εκτέλεσης κατακερματισμού).

3. Χρησιμοποιώντας το βήμα επιλογής μεγέθους που παρέχεται στο εγχειρίδιο προϊόντος, τι μπορεί να προκαλέσει μικρή απόκλιση στο τμήμα που έχει εισαχθεί;

Η επιλογή μεγέθους πρέπει να γίνεται αυστηρά σύμφωνα με το βήμα επιλογής μεγέθους σε αυτό το εγχειρίδιο προϊόντος. Εάν υπάρχει απόκλιση, ο λόγος μπορεί να είναι ότι τα μαγνητικά σφαιρίδια δεν είναι ισορροπημένα σε θερμοκρασία δωματίου ή δεν αναμειγνύονται πλήρως, η πιπέτα δεν είναι ακριβής ή το υγρό παραμένει στο άκρο. Συνιστάται να χρησιμοποιείτε τις συμβουλές με χαμηλή προσρόφηση για το πείραμα.

4. Επιλογή προσαρμογέων στην κατασκευή βιβλιοθηκών

Το κιτ κατασκευής βιβλιοθήκης δεν περιέχει αντιδραστήριο προσαρμογέα και συνιστάται να χρησιμοποιείτε αυτό το κιτ μαζί με τον προσαρμογέα TIANSeq Single-Index Adapter (Illumina) (4992641/4992642/4992378).

5. QC της βιβλιοθήκης

Ποσοτική ανίχνευση βιβλιοθήκης: Qubit και qPCR χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης μάζας και της μοριακής συγκέντρωσης της βιβλιοθήκης αντίστοιχα. Η λειτουργία είναι αυστηρά σύμφωνα με το εγχειρίδιο προϊόντος. Η συγκέντρωση της βιβλιοθήκης θα πληροί γενικά τις απαιτήσεις της αλληλουχίας NGS. Ανίχνευση εύρους διανομής βιβλιοθηκών: Χρήση Agilent 2100 Bioanalyzer για τον εντοπισμό του εύρους διανομής βιβλιοθηκών.

6. Επιλογή αριθμού κύκλου ενίσχυσης

Σύμφωνα με τις οδηγίες, ο αριθμός των κύκλων PCR είναι 6-12 και ο αριθμός των κύκλων PCR που απαιτούνται θα πρέπει να επιλέγεται σύμφωνα με το δείγμα εισόδου. Σε βιβλιοθήκες υψηλής απόδοσης, η υπερβολική ενίσχυση συμβαίνει συνήθως σε διάφορους βαθμούς, η οποία εκδηλώνεται με μια ελαφρώς μεγαλύτερη κορυφή μετά την κορυφή της περιοχής στόχου στην ανίχνευση του Agilent 2100 Bioanalyzer, ή η ανιχνευθείσα συγκέντρωση του Qubit είναι χαμηλότερη από αυτή του qPCR. Η ήπια υπερβολική ενίσχυση είναι ένα φυσιολογικό φαινόμενο, το οποίο δεν επηρεάζει την αλληλουχία βιβλιοθηκών και την επακόλουθη ανάλυση δεδομένων.

7. Το Spikes εμφανίζεται στο προφίλ ανίχνευσης του Agilent 2100 Bioanalyzer

Η εμφάνιση αιχμών στην ανίχνευση βιοαναλυτή Agilent 2100 οφείλεται στον άνιση κατακερματισμό των δειγμάτων, όπου θα υπάρχουν περισσότερα θραύσματα σε συγκεκριμένο μέγεθος, και αυτό θα γίνει πιο εμφανές μετά τον εμπλουτισμό PCR. Σε αυτή την περίπτωση, προτείνεται να μην πραγματοποιηθεί η επιλογή μεγέθους, δηλαδή να τεθεί η κατάσταση κατακερματισμού στους 94 ° C για 15 λεπτά επωασμένο, όπου η κατανομή του θραύσματος είναι μικρή και συμπυκνωμένη και η ομοιογένεια μπορεί να βελτιωθεί.