2 rich Μίγμα PCR πλούσιο σε GC

Πρότυπο Α-1

Το πρότυπο περιέχει ακαθαρσίες πρωτεΐνης ή αναστολείς Taq, κλπ. —— Καθαρίστε το πρότυπο DNA, αφαιρέστε τις ακαθαρσίες πρωτεΐνης ή εξαγάγετε το πρότυπο DNA με κιτ καθαρισμού.

Η μετουσίωση του προτύπου δεν είναι πλήρης —— Κατάλληλη αύξηση της θερμοκρασίας μετουσίωσης και παράταση του χρόνου μετουσίωσης.

Deg Υποβάθμιση προτύπου ——Ετοιμάστε ξανά το πρότυπο.

A-2 Primer

■ Κακή ποιότητα των εκκινητών ——Επανασύνθεση του αστάρι.

Deg Υποβάθμιση αστάρι ——Αποτίθενται τα αστάρια υψηλής συγκέντρωσης σε μικρό όγκο για διατήρηση. Αποφύγετε την πολλαπλή κατάψυξη και απόψυξη ή μακροχρόνια κρυοσυντήρηση 4 ° C.

■ Ακατάλληλος σχεδιασμός των αστάρι (π.χ. το μήκος του αστάρι δεν επαρκεί, το διμερές σχηματίζεται μεταξύ των αστάρι κ.λπ.)

Α-3 mg²⁺συγκέντρωση

■ Mg²⁺ η συγκέντρωση είναι πολύ χαμηλή —— Σωστή αύξηση του Mg²⁺ συγκέντρωση: Βελτιστοποιήστε το Mg²⁺ συγκέντρωση με μια σειρά αντιδράσεων από 1 mM έως 3 mM με διάστημα 0,5 mM για τον προσδιορισμό του βέλτιστου Mg²⁺ συγκέντρωση για κάθε πρότυπο και αστάρι.

A-4 Θερμοκρασία ανόπτησης

Η υψηλή θερμοκρασία ανόπτησης επηρεάζει τη σύνδεση του αστάρι και του προτύπου. —— Μειώστε τη θερμοκρασία ανόπτησης και βελτιστοποιήστε την κατάσταση με κλίση 2 ° C.

A-5 Χρόνος παράτασης

■ Μικρός χρόνος παράτασης —— Αυξήστε το χρόνο παράτασης.

Φαινόμενα: Αρνητικά δείγματα δείχνουν επίσης τις ζώνες ακολουθίας στόχων.

A-1 Μόλυνση PCR

■ Διασταυρούμενη μόλυνση της αλληλουχίας στόχου ή των προϊόντων ενίσχυσης —— Προσοχή να μην διοχετεύεται με πιπέτα το δείγμα που περιέχει την αλληλουχία στόχου στο αρνητικό δείγμα ή να μην χυθεί από τον σωλήνα φυγοκέντρησης. Τα αντιδραστήρια ή ο εξοπλισμός πρέπει να αποστειρωθούν σε αυτόκλειστο για να εξαλειφθούν τα υπάρχοντα νουκλεϊκά οξέα και η ύπαρξη μόλυνσης θα πρέπει να προσδιοριστεί μέσω πειραμάτων αρνητικού ελέγχου.

Cont Μόλυνση αντιδραστηρίου —— Απομακρύνετε τα αντιδραστήρια και αποθηκεύστε σε χαμηλή θερμοκρασία.

A-2 Primer

■ Mg²⁺ η συγκέντρωση είναι πολύ χαμηλή —— Σωστή αύξηση του Mg²⁺ συγκέντρωση: Βελτιστοποιήστε το Mg²⁺ συγκέντρωση με μια σειρά αντιδράσεων από 1 mM έως 3 mM με διάστημα 0,5 mM για τον προσδιορισμό του βέλτιστου Mg²⁺ συγκέντρωση για κάθε πρότυπο και αστάρι.

■ Ακατάλληλος σχεδιασμός αστάρι και η ακολουθία στόχος έχει ομολογία με την αλληλουχία μη στόχου. ——Επανασχεδιάστε αστάρια.

Φαινόμενα: Οι ζώνες ενίσχυσης PCR είναι ασυνεπείς με το αναμενόμενο μέγεθος, είτε μεγάλο είτε μικρό, ή μερικές φορές εμφανίζονται τόσο συγκεκριμένες ζώνες ενίσχυσης όσο και μη ειδικές ζώνες ενίσχυσης.

Αστάρι Α-1

■ Κακή ιδιαιτερότητα αστάρι

—— Επανασχεδιασμός αστάρι.

Concentration Η συγκέντρωση του αστάρι είναι πολύ υψηλή —— Αυξήστε σωστά τη θερμοκρασία μετουσίωσης και παρατείνετε το χρόνο μετουσίωσης.

Α-2 mg²⁺ συγκέντρωση

Το Mg²⁺ η συγκέντρωση είναι πολύ υψηλή —— Μειώστε σωστά τη συγκέντρωση Mg2+: Βελτιστοποιήστε το Mg²⁺ συγκέντρωση με μια σειρά αντιδράσεων από 1 mM έως 3 mM με διάστημα 0,5 mM για τον προσδιορισμό του βέλτιστου Mg²⁺ συγκέντρωση για κάθε πρότυπο και αστάρι.

Θερμοσταθερή πολυμεράση A-3

■ Υπερβολική ποσότητα ενζύμου —— Μειώστε την ποσότητα ενζύμου κατάλληλα σε διαστήματα 0,5 U.

A-4 Θερμοκρασία ανόπτησης

Temperature Η θερμοκρασία ανόπτησης είναι πολύ χαμηλή —— Αυξήστε κατάλληλα τη θερμοκρασία ανόπτησης ή υιοθετήστε τη μέθοδο ανόπτησης δύο σταδίων

Κύκλοι A-5 PCR

■ Πάρα πολλοί κύκλοι PCR —— Μειώστε τον αριθμό των κύκλων PCR.

Αστάρι Α-1—— Κακή εξειδίκευση —— Σχεδιάστε ξανά το αστάρι, αλλάξτε τη θέση και το μήκος του αστάρι για να ενισχύσετε την ιδιαιτερότητά του. ή πραγματοποιήστε ένθετη PCR.

A-2 Πρότυπο DNA

—— Το πρότυπο δεν είναι καθαρό —— Καθαρίστε το πρότυπο ή εξαγάγετε DNA με κιτ καθαρισμού.

Α-3 mg²⁺ συγκέντρωση

——Μγ²⁺ η συγκέντρωση είναι πολύ υψηλή —— Μειώστε σωστά το Mg²⁺ συγκέντρωση: Βελτιστοποιήστε το Mg²⁺ συγκέντρωση με μια σειρά αντιδράσεων από 1 mM έως 3 mM με διάστημα 0,5 mM για τον προσδιορισμό του βέλτιστου Mg²⁺ συγκέντρωση για κάθε πρότυπο και αστάρι.

A-4 dNTP

—— Η συγκέντρωση των dNTP είναι πολύ υψηλή —— Μειώστε τη συγκέντρωση του dNTP κατάλληλα

A-5 Θερμοκρασία ανόπτησης

—— Πολύ χαμηλή θερμοκρασία ανόπτησης —— Αυξήστε σωστά τη θερμοκρασία ανόπτησης

Κύκλοι Α-6

—— Πάρα πολλοί κύκλοι —— Βελτιστοποιήστε τον αριθμό κύκλου

Το πρώτο βήμα είναι να επιλέξετε την κατάλληλη πολυμεράση. Η κανονική πολυμεράση Taq δεν μπορεί να διορθώσει λόγω έλλειψης δραστηριότητας εξωνουκλεάσης 3'-5 'και η αναντιστοιχία θα μειώσει σημαντικά την απόδοση επέκτασης των θραυσμάτων. Επομένως, η κανονική πολυμεράση Taq δεν μπορεί να ενισχύσει αποτελεσματικά θραύσματα στόχους μεγαλύτερα από 5 kb. Η πολυμεράση Taq με ειδική τροποποίηση ή άλλη πολυμεράση υψηλής πιστότητας θα πρέπει να επιλεγεί για τη βελτίωση της απόδοσης επέκτασης και την κάλυψη των αναγκών της ενίσχυσης μεγάλου τμήματος. Επιπλέον, η ενίσχυση των μακρών θραυσμάτων απαιτεί επίσης αντίστοιχη προσαρμογή του σχεδιασμού του εκκινητή, του χρόνου μετουσίωσης, του χρόνου επέκτασης, του ρυθμιστικού ρΗ κλπ. Συνήθως, τα αστάρια με 18-24 bp μπορούν να οδηγήσουν σε καλύτερη απόδοση. Προκειμένου να αποφευχθεί ζημιά στο πρότυπο, ο χρόνος μετουσίωσης στους 94 ° C θα πρέπει να μειωθεί σε 30 δευτερόλεπτα ή λιγότερο ανά κύκλο και ο χρόνος αύξησης της θερμοκρασίας στους 94 ° C πριν από την ενίσχυση θα πρέπει να είναι μικρότερος από 1 λεπτό. Επιπλέον, η ρύθμιση της θερμοκρασίας επέκτασης στους 68 ° C περίπου και ο σχεδιασμός του χρόνου επέκτασης σύμφωνα με την ταχύτητα 1 kb/min μπορεί να εξασφαλίσει αποτελεσματική ενίσχυση μεγάλων θραυσμάτων.

Το ποσοστό σφάλματος της ενίσχυσης PCR μπορεί να μειωθεί χρησιμοποιώντας διάφορες πολυμεράσες DNA με υψηλή πιστότητα. Μεταξύ όλων των πολυμεράσεων Taq DNA που έχουν βρεθεί μέχρι τώρα, το ένζυμο Pfu έχει το χαμηλότερο ποσοστό σφάλματος και την υψηλότερη πιστότητα (βλ. Συνημμένο πίνακα). Εκτός από την επιλογή ενζύμων, οι ερευνητές μπορούν να μειώσουν περαιτέρω τον ρυθμό μετάλλαξης PCR βελτιστοποιώντας τις συνθήκες αντίδρασης, συμπεριλαμβανομένης της βελτιστοποίησης της σύνθεσης ρυθμιστικού διαλύματος, της συγκέντρωσης της θερμοσταθερής πολυμεράσης και της βελτιστοποίησης του αριθμού κύκλου PCR.